Этапы метаболических путей катализируемых регуляторными ферментами. Метаболизм

Живая клетка – это открытая система, которая постоянно обменивается с внешней средой веществами и энергией. В клетку поступают питательные вещества, которые используются в качестве строительного и энергетического материала, из клетки выводятся конечные продукты метаболизма.

В клетке постоянно происходит большое количество разнообразных химических реакций, которые формируют метаболические пути – последовательность превращения одних соединений в другие. Метаболизм – совокупность всех метаболических путей, протекающих в организме.

Выделяют – катаболизм (распад сложных веществ до простых с высвобождением энергии) и анаболизм (синтез более сложных веществ из простых веществ).

Все пути согласованы между собой во времени и пространстве. Эта согласованность протекания метаболических процессов обеспечивается сложными механизмами регуляции.

Организация химических реакций в метаболические пути

Оптимальная активность ферментов, регулирующих реакции метаболического пути, достигается благодаря определенной организации в клетке.

1. Пространственная локализация ферментов

Большинство ферментов локализовано внутри клетки, причем ферменты одного метаболического пути находятся в одном отделе клетки. Разделение метаболических путей важно для противоположно направленных процессов. Например, синтез жирных кислот происходит в цитоплазме, а их распад в митохондриях. Если бы такого разделения не существовало, то возникали бы бесполезные с физиологической точки зрения пути.

В метаболических путях продукт первой реакции служит субстратом второй и так далее до формирования конечного продукта. Промежуточные продукты одного пути могут высвобождаться из последовательных реакций и использоваться в других метаболических путях, т.е. все метаболические пути связаны между собой.

Пространственная организация ферментов может быть настолько выражена, что продукт реакции не может быть вычленен из метаболического пути и обязательно служит субстратом следующей реакции.

Такая организация метаболического пути называется мультиферментным комплексом. Эти комплексы связаны с мембранами. Пример такого комплекса – пируватдегидрогеназный комплекс, под действием которого происходит окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты.

1. Структура метаболических путей

Метаболические пути подразделяются на 4 типа. Если субстрат превращается в один продукт, то такой путь называется линейным (гликолиз). Чаще встречаются разветвленные пути – когда синтезируются разные продукты в зависимости от потребности клетки (синтез нуклеотидов). Также существуют циклический (цикл трикарбоновых кислот) и спиральный (β-окисление жирных кислот) метаболические пути.

Органоспецифичность

Ферменты находятся во всех клетках организма. В процессе дифференцировки клеток изменяется и их ферментный состав. Например, фермент аргиназа, участвующая в синтезе мочевины, находится в клетках печени. Это так называемый органоспецифичный фермент.

Компартментализация

Функционирование клетки обеспечивается пространственной и временной регуляцией метаболических путей. Пространственная регуляция связана с локализацией определенных ферментов в различных органеллах. В ядре находятся ферменты, связанные с синтезом ДНК и РНК, в цитоплазме – ферменты гликолиза, в лизосомах – гидролитические ферменты, в митохондриях – ферменты цикла трикарбоновых кислот и цепи переноса электронов.

Принципы регуляции метаболических путей

Все химические реакции в клетке протекают при участии ферментов. Чтобы воздействовать на скорость протекания метаболического пути, достаточно регулировать количество или активность ферментов. В каждом метаболическом пути есть ключевые ферменты, которые регулируют скорость всего пути. Эти ферменты называются регуляторными.

Регуляция скорости ферментативных реакций осуществляется на 3 уровнях:

Изменение количества молекул фермента

Доступность субстрата и кофермента

Изменение каталитической активности фермента

Регуляция количества молекул фермента в клетке

В клетке постоянно происходит синтез и распад белковой молекулы фермента

Аминокислоты Фермент

Регуляция синтеза фермента может происходить на любой стадии формирования белковой молекулы. Наиболее изучена регуляция синтеза белковой молекулы на уровне транскрипции, которая осуществляется гормонами и биологически активными молекулами. Распад ферментов менее изучен.

Регуляция скорости ферментативной реакции доступностью субстрата и кофермента

Главным и необходимым параметром, регулирующим скорость метаболического пути, является наличие первого субстрата. Чем выше его концентрация, тем выше скорость метаболического пути.

Другим параметром является наличие регенерированных коферментов. В реакциях дегидрирования коферментом дегидрогеназ служат окисленные формы НАД+, ФАД, ФМН, которые восстанавливаются в ходе реакции. Чтобы коферменты вновь участвовали в реакции, необходимо, что они вновь превратились в окисленную форму.

Регуляция каталитической активности фермента

Аллостерическая регуляция

Регуляция с помощью белок-белковых взаимодействий

Регуляция путем фосфорилирования/дефосфорилирования фермента

Регуляция протеолизом

Аллостерическая регуляция

Ферменты, имеющие такой механизм регуляции являются, как правило, олигомерными белками. Они состоят из нескольких (не менее 2 х) субъединиц, имеют активный и аллостерический центры, которые находятся на разных субъединицах. Присоединение эффектора (клеточного метаболита) в аллостерический центр вызывает кооперативные конформационные изменения всех протомеров.

Если в аллостерическом центре связывается эффектор (активатор), повышается связывание субстрата в активном центре и возрастает скорость реакции, которую катализирует этот фермент. Конформационные перестройки в активном центре фермента повышают или понижают его сродство к субстрату.

При увеличении в клетке концентрации активатора возрастает скорость его связывания в аллостерическом центре. Изменяется конформация регуляторной субъединицы фермента, происходят кооперативные конформационные изменения в ферменте, изменяется конформация активного центра фермента, повышается сродство фермента к субстрату и скорость ферментативной реакции. При понижении концентрации аллостерического активатора снижается скорость связывания регуляторного лиганда в аллостерическом центре. Изменяется конформация регуляторной субъединицы, происходят кооперативные конформационные изменения в ферменте, изменяется конформация активного центра, снижается сродство к субстрату и понижается скорость реакции.

Если же эффектором является ингибитор, то сродство фермента к субстрату и скорость превращения его в продукт снижаются.

Аллостерические ферменты регулируют скорость метаболических путей, которые представляют собой последовательность взаимосвязанных реакций, катализируемых разными ферментами

Е1 Е2 Е3 Е4

Вещество S превращается в продукт Р в результате 4 последовательных ферментативных реакций. Продукт одной реакции служит субстратом следующей.

Аллостерические ферменты катализируют:

Необратимые или частично обратимые реакции

Самые медленные, ключевые реакции

Реакции в местах разветвления метаболического пути

Регуляторные молекулы:

Конечные продукты метаболических путей

Субстраты метаболических путей

Промежуточные метаболиты или специфические молекулы

Например, катаболизм глюкозы до СО 2 и Н 2 О регулируется аллостерически.

Е1 Е2 Е3 Ем

глюкоза В С М N ….. ……. СО 2 , Н 2 О, АТФ

Значение данного процесса состоит в синтезе АТФ в клетке за счет катаболизма глюкозы. При увеличении отношения АТФ/АДФ скорость реакций данного метаболического пути снижается. Из представленной выше последовательности ферментативных реакций аллостерическим является Е3, так как он катализирует необратимую самую медленную реакцию.

При повышении уровня АТФ в клетке

АТФ взаимодействует с аллостерическим центром фермента Е3

Происходят кооперативные конформационные изменения фермента Е3

Снижается сродство Е3 к субстрату

Понижается активность и замедляется реакция катализируемая ферментом Е3

Понижается скорость метаболического пути

ГЛАВА 8. РЕГУЛЯТОРНЫЕ СИСТЕМЫ У ПРОКАРИОТ

Регуляция жизнедеятельности прокариотных организмов происходит на разных уровнях (транскрипционном, трансляционном, метаболическом, поведенческом) и охватывает процессы, протекающие в одной клетке и в клеточной популяции.

РЕГУЛЯЦИЯ КЛЕТОЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА

До последнего времени основное внимание было уделено изучению регуляции клеточного метаболизма прокариот. Полученные данные дают ясное представление о том, что над метаболическими функциями клетки надстроена эффективная и сложная система регуляции.

В интактной клетке практически все протекающие метаболические процессы регулируются. Одна и та же реакция может одновременно подвергаться нескольким видам регуляторного воздействия, неравноценным по направлению и силе действия. Следствием этого является строгая координация активности отдельных метаболических процессов, приводящая к тому, что любой организм в норме представляет собой хорошо отлаженное устройство с системой развитых регуляторных связен. Эффективность клеточных регуляторных механизмов очень высока. Именно они обеспечивают максимально экономичное использование питательных веществ среды, предупреждают избыточный синтез промежуточных и конечных метаболитов, отвечают за быструю адаптацию к изменившимся условиям Следовательно, клетка в зависимости от конкретных условии должна быть способна уменьшить или увеличить скорость синтеза определенных метаболитов или скорость образования клеточной энергии.

Поскольку практически все реакции в клетке катализируются ферментами, регуляция метаболизма сводится к регуляции интенсивности ферментативных реакций. Скорость последних может регулироваться двумя основными способами: путем изменения количества ферментов и/или изменения их активности, т. с. степени испольвания их каталитического потенциала.

Регуляция активности ферментов

Факторы, регулирующие активность ферментов, разнообразны по своей природе (). Физические факторы (температура, давление, свет, магнитное поле, электрические импульсы оказывают менее специфическое действие, чем химические. В свою очередь действие последних также может быть разделено на несколько типов. Одни химические вещества связываются с активным центром фермента, например субстраты, кофакторы, конкурентные ингибиторы, что приводит к изменению ферментативной активности. Другие вещества взаимодействуют со специальными участками на поверхности молекулы определенного типа фермента, не имеющими непосредственного отношения к центрам каталитической активности, но тем не менее приводящими к ее изменению.

Наконец, активность некоторых ферментов регулируется путем химической модификации их молекулы, в основе которой лежит ковалентное обратимое связывание с ферментом определенной группировки, что приводит к изменению его активности. У прокариот известны две ферментные системы, активность которых регулируется таким путем. Глутаминсинтетаза E. coli , катализирующая синтез глутамина, существует в двух формах, различающихся присутствием в одной из них остатка адениловой кислоты. Присоединение его с помощью ковалентной связи, катализируемое соответствующим модифицирующим ферментом, приводит к образованию менее активной аденилированной глутаминсинтетазы:

Удаление адениловой группы, ведущее к возникновению деаденилированной формы фермента, резко повышает его каталитическую активность. Аналогичный механизм регулирования активности фермента путем присоединения и удаления остатка уксусной кислоты (ацетилирование — деацетилирование) обнаружен для цитратлиазы у фотосинтезирующей бактерии Rhodopseudomonas gelatinosa . В этом случае активна ацетилированная форма фермента.

Наиболее быстрым, точным и тонким механизмом регуляции активности ферментов является регуляция, которой подвергается определенный тип ферментов, получивших название аллостерических 21 . Эти ферменты, как правило, занимают ключевые позиции в обмене веществ, располагаясь в "стратегических" пунктах клеточного метаболизма — начале метаболических путей или местах разветвлений, где расходятся или сходятся несколько путей.

21 Термин подчеркивает особенность данного типа фермента, заключающуюся в том, что вещества, регулирующие его активность, структурно отличаются от субстрата катализируемой им ферментативной реакции.

Аллостерические ферменты имеют каталитический и регуляторный (аллостерический) центры, пространственно разобщенные, но функционально тесно взаимосвязанные. Каталитическая активность фермента меняется в результате связывания с его регуляторным центром определенных метаболитов, называемых эффекторами. Кроме конечных продуктов данного пути, эффекторами могут быть субстраты ферментов, а также некоторые конечные продукты родственных метаболических путей. Если действие эффектора приводит к понижению каталитической активности фермента, такой эффектор называется отрицательным, или ингибитором. Положительным называют эффектор, действие которого повышает каталитическую активность фермента. Положительным эффектором, или активатором, чаще всего бывает субстрат данного фермента.

Связывание эффектора с регуляторным центром приводит к изменению сродства фермента к субстрату в результате какого-то конформационного изменения фермента ().

Наиболее простой случай аллостерической регуляции — регуляция первого фермента неразветвленного биосинтетического пути его конечным продуктом. Если конечный продукт накапливается в избытке, он подавляет активность первого фермента в процессе, называемом ингибированием по принципу обратной связи Примером такого типа регулирования является ингибирование биосинтеза L-изолейцина () Первый фермент на пути синтеза L-изолейцина L-треониндезаминаза является аллостерическим и ингибируется только L-изолейцином.

Для разветвленных путей биосинтеза (а к таким относится большинство биосинтетических путей) механизмы регуляции усложняются, так как от активности первого фермента зависит биосинтез нескольких конечных продуктов. Очевидно следующее: механизмы регулирования в этом случае должны быть видоизменены таким образом, чтобы перепроизводство одного конечного продукта не приводило к прекращению синтеза других связанных с ним конечных продуктов. Выработалось несколько механизмов контроля по принципу обратной связи применительно к разветвленным биосинтетическим путям. Они садятся к тому, что в этом случае в регулировании принимают участие нее конечные продукты этих путей. Если первый этап биосинтетического пути катализируется одним ферментом, на поверхности молекулы этого фермента имеются различные регуляторные центры, с каждым из которых связывается один из конечных продуктов, выполняющих функцию эффектора (). Некоторые аллостерические ферменты существуют в виде нескольких молекулярных форм (изоферментов). Изоферменты катализируют одну и ту же реакцию, но обладают разными регуляторными свойствами. Это связано с тем, что изоферменты имеют одинаковые каталитические, но разные регуляторныецентры. Каждый изофермент кодируется отдельным геном. Существование изоферментов позволяет конечным продуктам независимо друг от друга ингибировать активность определенного изофермента, так как каждый изофермент индивидуально контролируется "своим" конечным продуктом ().

Регуляция синтеза ферментов

Регулирование конечным продуктом активности аллостерического фермента определенного биосинтетического пути обеспечивает мгновенную реакцию, приводящую к изменению выхода этого продукта. Если последний оказывается ненужным, отпадает надобность и в ферментах, участвующих в его синтезе. Проявлением максимальной экономичности клеточного метаболизма служат выработанные клеткой механизмы, регулирующие ее ферментный состав. Очевидна целесообразность синтеза только тех ферментов, которые необходимы в конкретных условиях. Показано, что у прокариот в одних условиях фермент может содержаться в количестве не более 1 — 2 молекул, в других — составлять несколько процентов от клеточной массы.

Количество определенного фермента в клетке может регулироваться на нескольких уровнях: на этапе транскрипции, трансляции, а также в процессе сборки и разрушения ферментного белка (см. ). В иерархии регуляторных воздействий наиболее сложный механизм, контролирующий количество ферментов в клетке, связан с процессом транскрипции. Специфические химические сигналы могут инициировать или блокировать транскрипцию определенного участка ДНК в иРНК. В случае индукции образованная иРНК участвует в определенной последовательности реакций, называемой трансляцией и заканчивающейся синтезом полипептидных цепей. Регуляция белкового синтеза на уровне трансляции может осуществляться на любом из ее этапов, например на этапе инициации, элонгации и др. Не исключена также возможность изменения времени жизни иРНК. под воздействием разных эффекторов, в том числе конечных продуктов метаболических путей. Хотя механизмы регуляции синтеза белка на уровне трансляции еще точно не установлены, ясно, что на этом этапе имеются широкие возможности для регуляции скорости синтеза различных белков.

Известно, что фермент может выполнять метаболическую функцию после приобретения соответствующей структуры. Скорость образования структур высшего порядка также находится под контролем определенных молекул. Таким образом, контроль на уровне сборки функционально активного фермента может играть существенную роль в метаболической регуляции. Наконец, скорость разрушения фермента под воздействием специфических метаболических сигналов будет также определять его концентрацию в клетке.

Регуляция синтеза ферментов на этапе транскрипции основана на том, что "считывание" бактериальных генов происходит избирательно и скорость образования копий соответствующих иРНК (а отсюда и дальнейшая их трансляция в белки) находится под сложным контрольным механизмом. Скорость синтеза ферментов, определяемая этой стадией, может меняться в разной степени. По данному признаку все ферменты делятся на два класса. Ферменты, синтез которых в растущей клетке происходит с постоянной скоростью в результате постоянного транскрибирования соответствующих генов и, следовательно, они присутствуют в клетке в более или менее постоянной концентрации, называются конститутивными. К ним относятся, например, гликолитические ферменты. Метаболические пути, функционирующие с участием конститутивных ферментов, контролируются посредством других регуляторных воздействий, например аллостерического ингибирования.

Кроме этого в бактериальных клетках имеются ферменты, количества которых могут резко меняться в зависимости от состава питательных веществ среды. Это происходит в результате того, что гены, детерминирующие эти ферменты, включаются или выключаются по мере надобности. Их называют индуцибельными. При отсутствии в среде субстратов этих ферментов последние содержатся в клетке в следовых количествах. Если в среду добавить вещество, служащее субстратом определенного фермента, происходит быстрый синтез этого фермента в клетке, т. е. имеет место индукция синтеза фермента. Если же в питательной среде в готовом виде содержится вещество, являющееся конечным продуктом какого-либо биосинтетического пути, происходит быстрое прекращение синтеза ферментов этого пути. Это явление получило название репрессии конечным продуктом. Ферменты, синтез которых подавляется конечным продуктом, могут быть дерепрессированы, т. е. скорость их синтеза превысит обычную, если концентрация конечного продукта упадет до очень низкого уровня. Дерепрессия этих ферментов аналогична явлению индукции.

Репрессия конечным продуктом. Все биосинтетические пути находятся под контролем механизма репрессии конечным продуктом. Точно так же образование большинства анаболических ферментов регулируется путем репрессии их синтеза. Репрессия осуществляется особыми присутствующими в клетке веществами — репрессорами. Факторами, модифицирующими активность репрессоров, могут быть конечные продукты биосинтетических путей, а также промежуточные продукты некоторых катаболических или амфиболических путей.

Репрессия может быть координированной, т. е. синтез каждого фермента данного пути в одинаковой степени подавляется конечным продуктом. Часто синтез ферментов одного пути репрессируется в разной степени. В разветвленных биосинтетических путях механизмы репрессии могут быть модифицированы (как и механизмы ингибирования), чтобы лучше обеспечить регуляцию нескольких конечных продуктов из общего исходного субстрата. Синтез многих ферментов в таких путях репрессируется только при совместном действии всех конечных продуктов. Если реакция на общем участке разветвленного пути катализируется изоферментами, синтез каждого из них находится под контролем "своего" конечного продукта (см. ).

Механизм репрессии конечным продуктом на уровне транскрипции стал проясняться с 50-х гг. Большой вклад в это внесли работы Ф. Жакоба и Ж. Моно. Было показано, что наряду со структурными генами, кодирующими синтез ферментов, в бактериальном геноме существуют специальные регуляторные гены. Один из них — ген-регулятор (ген R), функция которого заключается в регуляции процесса транскрипции структурного гена (или генов). Ген-регулятор кодирует синтез специфического аллостерического белка-репрессора, имеющего два центра связывания: один узнает определенную последовательность нуклеотидов на участке ДНК, называемом оператором (ген О), другой — взаимодействует с эффектором. Ген-оператор расположен рядом со структурным геном (генами) и служит местом связывания репрессора. В отличие от операторных генов гены-регуляторы расположены на некотором расстоянии от структурных генов (продукты регулярных генов — репрессоры являются свободно диффундирующими белковыми молекулами).

Часто структурные гены, относящиеся к одному биохимическому пути, объединены в группу, составляющую вместе с оператором единицу транскрипции и регуляции — оперон. Все структурные гены, объединенные в оперон, имеют один операторный участок, локализованной на краю оперона, и координирование регулируются одним репрессором. Оперон представляет собой весьма рациональную и эффективную систему регуляции метаболического пути.

Рис. 32. Триптофановый оперон Е. coli и механизм репрессии конечным продуктом. А — продукт гена-регулятора (R) — неактивная форма репрессора, неспособная связываться с оператором (О); промоторный участок (Р) открыт: происходит транскрипция структурных генов (Е, D, С, В, А). Б — в присутствии корепрессора образуется активный комплекс корепрессор — репрессор, связывающийся с оператором и закрывающий промотор; транскрипции не происходит (по Lehninger, 1974)

Процесс транскрипции начинается с прикрепления РНК-полимеразы, катализирующей синтез иРНК, к определенному участку ДНК, называемому промотором (Р). Когда молекула репрессора "садится" на операторный участок, она "закрывает" промотор, тем самым препятствуя связыванию с ним РНК-полимеразы и началу транскрипции. У прокариот пять генов, кодирующих синтез ферментов триптофанового пути, образуют оперон (рис. 32). Ген-регулятор обеспечивает синтез аллостерического белка — триптофанового репрессора, не активного в свободном состоянии. Последний в таком виде не связывается с операторным участком и, следовательно, не может препятствовать началу транскрипции. Когда конечный продукт метаболического пути (триптофан) накапливается выше определенного уровня, он взаимодействует с репрессором и активирует его.

Активированный репрессор присоединяется к операторному участку и подавляет транскрипцию триптофанового оперона. Таким образом, триптофан является корепрессором.

Индукция синтеза ферментов. В большинстве случаев регуляция путем индукции характерна для катаболических путей, где в качестве индукторов выступают обычно субстраты этих путей. Классический пример индуцибельного фермента — (3-галактозидаза Е. coli . Оказалось, что если клетки Е. coli выращивать в среде, содержащей глюкозу, то они не могут использовать лактозу. Если такие клетки поместить в среду, где лактоза — единственный источник углерода, после некоторого периода в них происходит интенсивный синтез фермента (3-галактозидазы, катализирующего гидролиз лактозы на D-глюкозу и D-галактозу. С помощью этого фермента Е. coli может теперь использовать лактозу в качестве единственного источника углерода. Если затем клетки, растущие на среде с лактозой, перенести на среду с глюкозой, синтез (3-галактозидазы прекращается.

Изучение индукции (3-галактозидазы у Е. coli позволило установить, что рост клеток на среде с лактозой происходит не в результате отбора мутантов, у которых способность использовать лактозу есть следствие мутации. Способностью синтезировать этот фермент обладают все клетки. Было также показано, что в процессе индукции происходит не активирование уже имеющегося в клетках фермента (З-галактозидазы, а его синтез de novo из аминокислот.

Индуцированный синтез ферментов у микроорганизмов был описан в 30-х гг., но механизм этого процесса долгое время оставался непонятен. Индуцированный синтез ферментов лежит в основе широко известного явления адаптации организмов к различным условиям. Успехи, достигнутые в расшифровке механизмов регуляции клеточного метаболизма, позволили объяснить природу этого явления, его механизм и роль в клетке.

Лактозный оперон Е. coli , состоящий из трех структурных генов, промотора и оператора, был первой ферментной системой, на которой Ж. Моно и Ф. Жакоб изучали механизм индукции синтеза ферментов (). В отсутствие лактозы молекула репрессора, активная в свободном состоянии, связывается с оператором и подавляет транскрипцию структурных генов. Когда в клетку попадает лактоза, она связывается с репрессором, в результате образуется неактивный комплекс репрессора с индуктором, который не может взаимодействовать с оператором и, следовательно, препятствовать транскрипции структурных генов. В результате индуцируется синтез ферментов катаболизма лактозы. При удалении из клетки индуктора репрессор снова переходит в активное свободное состояние, связывается с оператором, что приводит к прекращению синтеза соответствующих ферментов.

Катаболитная репрессия. Кроме репрессии конечным продуктом, характерной для анаболических путей, описан тип репрессии, называемой катаболитной и заключающейся в том, что быстро используемые клеткой источники энергии способны подавлять синтез ферментов других путей катаболизма, участвующих в метаболизировании сравнительно медленно используемых источников энергии. Катаболитную репрессию можно рассматривать как приспособление клетки к использованию в первую очередь наиболее легко доступных источников энергии. В присутствии такого источника энергии потребление других субстратов, менее "удобных" для клетки, временно приостанавливается, и пути катаболизирования этих субстратов временно выключаются.

Выше уже отмечалось, что если в среде для выращивания Е. coli одновременно содержатся глюкоза и лактоза, сначала используется глюкоза. Несмотря на присутствие индуктора лактозного оперона, ферменты, участвующие в катаболизме лактозы, не синтезируются. Транскрипция генов лактозного оперона начинается, когда концентрация глюкозы в среде становится низкой. Таким образом, глюкоза препятствует синтезу ферментов лактозного оперона.

Как это осуществляется? Изучение механизма катаболитной репрессии обнаружило, что этот тип регуляции тесно связан с внутриклеточным уровнем циклического АМФ (цАМФ), который в этом процессе функционирует в качестве эффектора. Он образует комплекс с аллостерическим белком — катаболитным активатором, не активным в свободном состоянии. Этот комплекс, присоединившись к определенному участку на промоторе, обеспечивает возможность связывания РНК-полимеразы с промотором и инициацию транскрипции. Количество образующегося комплекса определяется концентрацией цАМФ, которая уменьшается при увеличении содержания глюкозы в среде. Таким образом, глюкоза вызывает изменение внутриклеточной концентрации цАМФ. Это соединение обнаружено в клетках всех прокариот. Его единственная функция — регуляторная. Циклический АМФ образуется из АТФ в реакции, катализируемой аденилатциклазой, связанной с ЦПМ:

АТФ ® цАМФ + пирофосфат.

Аденилатциклаза обладает высокой активностью, если компоненты системы транспорта глюкозы в клетку фосфорилированы. Это происходит в отсутствие глюкозы, которую необходимо транспортировать. Таким образом, активность аденилатциклазы возрастает при уменьшении концентрации глюкозы в среде. Последнее приводит к повышению образования цАМФ и в конечном итоге к индукции синтеза ферментов катаболизма лактозы. Наоборот, при высокой концентрации глюкозы в среде система ее транспорта находится в дефосфорилированном состоянии, следствием чего является уменьшение активности аденилатциклазы и соответственно количества цАМФ. Таким способом глюкоза через систему своего транспорта регулирует концентрацию цАМФ в клетке. Поскольку катаболизм глюкозы связан с образованием метаболической энергии и запасанием ее в молекулах АТФ, через глюкозу в клетке связаны пулы АТФ и цАМФ: при увеличении количества АТФ уменьшается количество цАМФ и наоборот.

Особенностью всех ферментных систем, находящихся под контролем катаболитной репрессии, является участие в их индукции универсального комплекса, состоящего из белкового катаболитного активатора и цАМФ.

Регуляция различных метаболических путей

Биосинтетические пути регулируются преимущественно по механизму аллостерического ингибирования первого фермента и репрессии синтеза ферментов этого пути конечным продуктом. Регулирование разветвленных биосинтетических путей осуществляется с помощью усложненных вариантов этих же механизмов.

Основные механизмы, регулирующие катаболические пути, — индукция синтеза ферментов и катаболитная репрессия. Катаболические пути, в которых функционируют конститутивные ферменты, регулируются большей частью посредством аллостерических воздействий на активность ферментов. Одна из задач катаболических путей — обеспечение клетки энергией. У большинства прокариот возможности генерации энергии намного превышает потребности в ней клетки. Количество АТФ, которое можно синтезировать с помощью имеющихся в клетках аэробных прокариот ферментов гликолитического и дыхательного путей, значительно больше количества АТФ, необходимого для процессов биосинтеза и поддержания жизнедеятельности. Поэтому клетки должны обладать способностью контролировать потребление энергодающих субстратов и, следовательно, выработку клеточной энергии. Основной принцип контроля прост: АТФ синтезируется только тогда, когда он необходим, Иными словами, интенсивность энергетических процессов у прокариот регулируется внутриклеточным содержанием АТФ.

Адениловые нуклеотиды относятся к числу важнейших эффекторов. АМФ и АДФ действуют как положительные эффекторы, стимулирующие скорость энергетических процессов и, следовательно, повышающие выход АТФ. Наоборот, АТФ служит отрицательным эффектором, сигнализирующим о превышении процессов образования АТФ над его потреблением. В результате регуляции процессов синтеза и распада АТФ в клетке поддерживается стационарное энергетическое состояние, характеризующееся так называемым энергетическим зарядом клетки:

Величина энергетического заряда теоретически может колебаться от 1 (в клетке все адениловые нуклеотиды только в виде АТФ) до 0 (в клетке содержится только АМФ). В растущей культуре величина энергетического заряда клетки равна примерно 0,8. Уменьшение его свидетельствует об ухудшении энергообеспечения организма. Когда эта величина становится ниже 0,5, клетки погибают.

Помимо адениловых нуклеотидов в регулировании энергетических процессов активную роль играют система НАД(Ф)+/НАД(Ф)-H 2 коферментов и величина трансмембранного электрохимического градиента ионов водорода в виде обоих его составляющих (Dy pH и D pH). Преобладание аллостерического взаимодействия восстановленной или окисленной форм НАД(Ф) с ферментами катаболического пути приводит соответственно к понижению или повышению их активности. Достижение определенного порогового значения Dm H + на энергопреобразующей мембране служит определенным сигналом, тормозящим поступление ионов водорода против градиента.

Регуляция процессов активного транспорта, обеспечивающего поступление подавляющего большинства необходимых прокариотам веществ, происходит на уровне синтеза переносчика и его функционирования. Биосинтез белковых компонентов многих транспортных систем регулируется по типу индукции. Глюкоза, транспортная система которой у большинства прокариот конститутивна, подавляет образование транспортных систем других сахаров и ряда органических кислот путем катаболитной репрессии. Исключение составляют некоторые облигатно аэробные прокариоты, у которых транспорт органических кислот конститутивен, а индуцируемой является транспортная система глюкозы. Избыток субстрата в среде может репрессировать синтез соответствующей транспортной системы. Это особенно характерно для аминокислот. В этом случае регуляция транспорта координирована с регуляцией их последующего метаболизма. Обнаружена также регуляция транспорта по типу отрицательной обратной связи, когда субстрат, накопленный внутри клетки, подавляет собственный транспорт из внешней среды. Таким образом, процессы клеточного транспорта находятся под контролем тех же механизмов, что и внутриклеточные анаболические и катаболические процессы.

Получение мутантов с нарушениями в системе регуляции клеточного метаболизма, приводящими к сверхсинтезу определенных метаболитов, широко используется для получения аминокислот, витаминов, полисахаридов и других веществ, имеющих практическое значение.

РЕГУЛЯЦИЯ МЕЖКЛЕТОЧНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ

Прокариоты синтезируют вещества, регулирующие не внутриклеточный метаболизм, а межклеточные взаимодействия. Особенностями этих веществ, называемых ауторегуляторами, являются выделение их в окружающую среду, проявление биологической активности в очень низкой концентрации (10 –9 — 10 –12 M) и воздействие не на организмы иного вида, а на другие особи (клетки) того же вида. Эти вещества выделяются клетками прокариот в обычных условиях культивирования и обнаруживают строгую видо- или родоспецифичность.

Как правило, реакция, вызываемая ауторегулятором, связана с жизненным циклом прокариот. Так, стадия формирования плодовых тел в жизненном цикле миксобактерий (см. рис. 21) индуцируется ауторегулятором. веществом липидной природы, выделяемом вегетативными клетками. Клетки Myxococcus xanthus выделяют вещества, вызывающие споруляцию этого вида при их концентрации в среде порядка 10 –10 M. У Streptococcus faecalis установлен половой процесс. В клетках-реципиентах синтезируются специфические ауторегуляторы (половые регуляторы, или феромоны), под воздействием которых клетки-доноры приобретают способность прилипать к реципиенту. В результате повышается вероятность образования пары донор — реципиент.

Vibrio fischeri — обычный светящийся симбионт рыб семейства Monocentudae. Синтезируемый им ауторегулятор стимулирует образование нескольких компонентов системы свечения. Эффект обнаруживается при концентрации ауторегулятора 10 нМ, что соответствует примерно 1–2 молекулам этого соединения на бактериальную клетку. Оптимальная концентрация порядка 200 нМ (приблизительно 40 молекул ауторегулятора на клетку).

Несколько видов ауторегуляторов, контролирующих синтез антибиотика и спорообразование, обнаружено у актиномицета Streptomyces griseus. Необычное циклическое соединение, индуцирующее образование спор, идентифицировано в клеточных выделениях цианобактерии Cylindrospermum licheniforme.

Таким образом, прокариотные организмы синтезируют химические вещества-сигналы, регулирующие различные процессы, связанные с межклеточными взаимодействиями в популяции одного вида или даже штамма. Место действия ауторегуляторов — клеточные ферменты. Примечательно, что большинство изученных регуляторов — вещества липидной природы. Это позволяет им легко диффундировать через клеточные мембраны без помощи специальных транспортных систем. Феромоны S. faecalis — пептиды, содержащие 8 аминокислотных остатков, единственная гидрофильная аминокислота, входящая в состав этих пептидов, — серин. Гидрофобный характер пептидных феромонов S. faecalis также указывает на возможный неспецифический механизм их переноса через клеточные мембраны.

Выявление нового класса веществ — регуляторов жизнедеятельности прокариот на межклеточном уровне — интересно тем, что позволяет рассматривать эти организмы не просто как популяцию разрозненных клеток, но указывает на существование более высокого уровня их организации.

М.В.Гусев, Л.А.Минеева 1992-2001
Кафедра клеточной физиологии и иммунологии биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова 2000-2001

Целью любого биотехнологического производства является получение максимально возможного количества целевого продукта с единицы объема установки при минимально возможных затратах. На практике существует два основных пути решения этих задач, которые заключаются с одной стороны в создании новых штаммов микроорганизмов, обладающих повышенной продукционной способностью, т.е. способностью к синтезу того или иного целевого продукта, а с другой стороны в создании оптимальных условий для протекания в клетках интересующего нас метаболитического процесса.

Решение этих задач в той или иной степени связано с изменением регуляторных процессов в клетке, поэтому в настоящем разделе мы рассмотрим некоторые механизмы регуляции биохимической активности бактериальной клетки.

В нормально функционирующей живой клетке одномоментно протекает множество катализируемых ферментами химических реакций, приводящих к образованию огромного количества разнообразных соединений. В норме обмен веществ в клетке (метаболизм ) осуществляется по принципам строжайшей экономии энергии и вещества, что обеспечивается сложнейшей системой регуляции обмена веществ.

Все процессы клеточного метаболизма можно условно разделить на две группы.

1. Процессы, в которых происходит разложение сложных веществ до более

простых с получением энергии называются катаболитическими катаболитами .

2. Процессы, в которых происходит синтез сложных веществ из простых с потреблением энергии называются анаболитическими , а промежуточные и конечные продукты – анаболитами .

Между катаболитическими и анаболитическими процессами в клетке существует тесная взаимосвязь. Катаболитические процессы служат источником энергии и “строительного материала” для анаболитических процессов, а продукты анаболизма могут служить субстратом для катаболитичких процессов (питательные вещества) или выполнять функции катализаторов (белки-ферменты).

Самый простой способ регуляции любого метаболического пути основывается на доступности субстрата. Действительно, в соответствии с законом действия масс, снижение количества субстрата-реагента (его концентрации в среде) приводит к снижению скорости протекания процесса (реакции) через данный метаболический путь. С другой стороны, повышение концентрации субстрата приводит к стимулированию этого метаболического пути. Поэтому, независимо от каких-то иных факторов, наличие (доступность) субстрата является важнейшим механизмом интенсификации любого метаболического процесса. Иногда эффективным средством повышения выхода целевого продукта является увеличение концентрации в клетке какого-либо определенного предшественника. Однако, в отличие от химических процессов, в биотехнологии данный путь имеет свои ограничения, т.к. высокие концентрации субстратов (больше 3-5%), например глюкозы или сахарозы, обычно резко тормозят рост микроорганизмов, что используется, например, для консервирования ягод и фруктов. Связано это, прежде всего с осмотическим эффектом, который вызывается большой разностью в концентрации этих веществ внутри клеток и в окружающей среде.

Однако в клетках имеется на много порядков более эффективный механизм контроля метаболитических процессов, основанный на регуляции ферментативного аппарата клетки. Такая регуляция может осуществляться по крайней мере двумя путями. Один из них очень быстрый (реализующийся в течение секунд или минут) заключается в изменении каталитической активности уже имеющихся молекул фермента. Второй, более медленный (реализуется в течение многих минут), состоит в изменении скоростей синтеза (количества) ферментов. В обоих механизмах используется единый принцип управления системами – принцип обратной связи.

Поскольку все процессы протекающие в клетке требуют участия специфических белковых катализаторов – ферментов, то общее количество ферментов в клетках может варьироваться от нескольких десятков до нескольких сотен, а процентная доля их по отношению к другим клеточным белкам будет достаточно большой (до нескольких процентов даже для одного фермента).

Однако энергетических (АТФ) и сырьевых ресурсов клетки (аминокислот) не хватает для одновременного синтеза всех необходимых ферментов. Поэтому постоянно синтезируются только те ферменты, которые поддерживают основные клеточные функции (например ферменты гликолиза, ЦТК). Такие ферменты называют конститутивными. Другие ферменты, адаптивные или индуцибельные, синтезируются только в ответ на появление каких то внешних факторов или веществ – индукторов, которые являются субстратами (питательными веществами) или их аналогами.

Уровень синтеза таких ферментов регулируется двумя механизмами – индукцией и репрессией .

Под индукцией понимают относительное увеличение синтеза одного фермента или группы ферментов, участвующее в одной и той же последова-тельности реакций, например в разложении какого-то сложного вещества до более простых. Ферменты, синтез которых регулируется таким образом, называют адаптивными или индуцированными (индуцибельными ), а субстраты, вызывающие их синтез - индукторами . Под влиянием индукторов количество адаптив­ных ферментов может возрастать в сотни раз. Так, для E.coliуста­новлено, что у культуры, выросшей на среде с глюкозой, обнаруживает лишь следы β-галактозидазы, осуществляющей реакцию расщепления лактозы до α-галактозы и D-глюкозы. При перенесении культуры на среду с лактозой, уже через несколько минут, начинается активный синтез β-галактозидазы и у адаптированной культуры до 3% от содержания белка приходится на этот фермент.

Для индуцируемых ферментов установлено, что:

а) фермент появляется во всех клетках одновременно и это нельзя объяснить мутациями;

б) индуцированный фермент целиком синтезируется в клетке из аминокислот или, как говорят, образуется de novo (изначально).

в) фермент синтезируется до тех пор, пока в среде есть индуктор. Через индукцию регулируется синтез ферментов, участвующих в катаболических процессах, т.е. индуцируемые ферменты необходимы для пог­лощения клеткой субстратов и включения их в обмен.

При промышленном получении ферментов, часто великолепными индукторами являются неутилизируемые структурные аналоги субстратов. Например, для β-галактозидазы таким веществом служит изопропил-β – D-тио-галактопиранозид (ИПТГ) неметаболизируемый аналог лактозы. Это позволяет увеличить выход фермента, который при этом не расходуется в ферментативной реакции и облегчить его очистку т.к. ИПТГ берется в количестве значительно меньшем, чем лактоза и в культуральной жидкости нет продуктов ее распада.

Вторым механизмом регуляции синтеза ферментов является репрес­сия , когда наблюдается относительное уменьшение синтеза фермента или группы ферментов, участвующих в одной и той же последователь­ности реакций, В зависимости от природы репрессоров различают реп­рессию конечным продуктом и репрессию катаболитами . Репрессия конечным продуктом наблюдается только для ферментов, осуществлявших анаболические реакции. При наличии в клетке конечного продукта ана­болического пути снижается скорость синтеза всех ферментов, участ­вующих в его образовании. Этот процесс позволяет экономить клеточ­ный белок, останавливая синтез тех ферментов, которые в данный мо­мент не требуются клетке.

Репрессия катаболитами характерна для реакций разложения сложных органических веществ микроорганизмами. Этот механизм позволяет клетке использовать более доступный субстрат, обеспечивавший высо­кую скорость роста культуры. Предпочтение отдается тем субстратам, разложение которых включает меньшее число стадий: микроорганизмы предпочитают простые сахара сложным, аминокислоты - пептидам и т.д. Одним из примеров катаболитной репрессии является “глюкозный эф­фект" - явление, наблюдаемое при выращи-вании микроорганизмов на средах, содержащих наряду с глюкозой другие источники углерода. Глюкоза, как наиболее легко усвояемый субстрат, метаболизируется в клетке и продукты ее разложения тормозят синтез ферментов, участвующих в усвоении более сложных субстратов до тех пор, пока не будет использована вся глюкоза.

Регуляция обмена веществ микробной клетки может происходить также путем изменения ферментативной активности имеющихся ферментов. Это явление наблюдается преимущественно в анаболитических процессах. Наиболее изученным механизмом является ингибирование активности ферментов конечным продуктом (ретроингибирование), когда активность фермента, стоящего в начале многоступенчатого превращения субстрата тормозится конечным метаболитом.

Впервые о наличии такого регуляторного механизма было сообщено в 1953 г. При изучении биосинтеза триптофана клетками E.coli. Заключительный этап биосинтеза данной ароматической аминокислоты состоит из нескольких, катализируемых индивидуальными ферментами стадий. Было обнаружено, что у одного из мутантов E. coli с нарушенным биосинтезом триптофана добавление данной аминокислоты (являющейся конечным продуктом этого биосинтетического пути) резко тормозит накопление одного из предшественников – индол глицерофосфата в клетках. Уже тогда было высказано предположение, что триптофан ингибирует активность какого-то фермента, катализирующего образование индол глицерофосфата. Несколько позднее было четко установлено, что таким чувствительным к триптофану ферментом является антранилатсинтетаза, которая катализирует более раннюю реакцию триптофанового пути – образование антраниловой кислоты из хоризмовой кислоты и глутамина. Этот факт был экспериментально обоснован в опыте, когда добавление триптофана в клеточные экстракты E. coli, содержащие фермент антранилатсинтетазу и его субстраты (хоризмат и глутамин), приводило к резкому ингибированию образования антранилата. Более того, было однозначно продемонстрировано, что активность антранилатсинтетазы подавляется только триптофаном и никакие другие метаболиты клетки подобного действия не оказывают.

Благодаря этому явлению у микроорганизмов предотвращается перепроизводство низкомолекулярных промежуточных продуктов обмена, таких, как аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды. Как правило, субстрат ингибируемого фермента резко отличается от конечного продукта - ингибитора и это обстоятельство позволяет считать, что конечный продукт соединяется не с активным центром фермента, а со специальным регуляторным или аллостерическим (от греч. «аллос» – другой, «стерос» – пространственный), центром. Присоединение конечного продукта к аллостерическому центру фермента сопровождается утратой нормальной каталитической активности вследствии конформационных изменений структуры белковой молекулы.

По сравнению с индукцией и репрессией ретроингибирование это инструмент быстрого и точного регулирования метаболитических процессов.

Ретроингибирование является крайне нежелательным явлением при промышленном получении тех или иных интересующих человека клеточных метаболитов, т.к. препятствует их накоплению в высоких концентрациях, что требует использования установок большего объема и усложняет процесс их выделения и очистки. А это в свою очередь увеличивает себестоимость продукции. Существует несколько подходов, позволяющих снять или значительно уменьшить эффект ретроингибирования. Один из них состоит в том, что целевой продукт (ингибитор), удаляют. Например, если он является эндометаболитом, то создаются условия для его ухода из клетки в культуральную жидкость, например за счет повышения проницаемости клеточных оболочек. Если целевой продукт является экзометаболитом (аминокислоты, антибиотики), то его удаляют из культуральной жидкости, например, переводя в нерастворимое состояние (осадок). Второй подход состоит в том, что на стадии синтеза продукта в культуральную жидкость добавляют вещество-промежуточный метаболит, синтез которого блокируется конечным продуктом (см. синтез триптофана). Недостатком этого подхода является то, что такой предшественник не всегда может быть получен дешево и в больших количествах. На практике, если возможно, обычно применяют оба подхода.

Другие подходы связаны с использованием методов мутагенеза-селекции и генной инженерии. Например, при мутационном изменении аллостерического центра (центра взаимодействия с ингибитором) чувствительность к ингибитору утрачивается и фермент сохраняет свою активность при высоких концентрациях конечного продукта, что позволяет создать более высокопродуктивные штаммы микроорганизмов-продуцентов. Более сложный вариант данного подхода реализуется при микробиологическом получении лизина (см. синтез лизина).

Принципы регуляции метаболических путей

Все химические реакции в клетке протекают при участии ферментов. Поэтому, чтобы воздействовать на скорость протекания метаболического пути, достаточно регулировать количество или активность ферментов. Обычно в метаболических путях есть ключевые ферменты, благодаря которым происходит регуляция скорости всего пути. Эти ферменты (один или несколько в метаболическом пути) называются регуляторными ферментами; они катализируют, как правило, начальные реакции метаболического пути, необратимые реакции, скорость-лимитирующие реакции (самые медленные) или реакции в месте переключения метаболического пути (точки ветвления).

Регуляция скорости ферментативных реакций осуществляется на 3 независимых уровнях:

• · изменением количества молекул фермента;
• · доступностью молекул субстрата и кофермента;
• · изменением каталитической активности молекулы ферманта.

Регуляция каталитической активности ферментов

Важнейшее значение в изменении скорости метаболических путей играет регуляция каталитической активности одного или нескольких ключевых ферментов данного метаболического пути. Это высокоэффективный и быстрый способ регуляции метаболизма.

Основные способы регуляции активности ферментов:

• · аллостерическая регуляция;
• · регуляция с помощью белок-белковых взаимодействий;
• · регуляция путём фосфорилирования/дефосфорилирования молекулы фермента;
• · регуляция частичным (ограниченным) протеолизом.

Аллостерическая регуляция

Аллостерическими ферментами называют ферменты, активность которых регулируется не только количеством молекул субстрата, но и другими веществами, называемыми эффекторами. Участвующие в аллостерической регуляции эффекторы - клеточные метаболиты часто именно того пути, регуляцию которого они осуществляют.

Аллостерические ферменты играют важную роль в метаболизме, так как они чрезвычайно быстро реагируют на малейшие изменения внутреннего состояния клетки. Аллостерическая регуляция имеет большое значение в следующих ситуациях:

• · при анаболических процессах. Ингибирование конечным продуктом метаболического пути и активация начальными метаболитами позволяют осуществлять регуляцию синтеза этих соединений;
• · при катаболических процессах. В случае накопления АТФ в клетке происходит ингибирование метаболических путей, обеспечивающих синтез энергии. Субстраты при этом расходуются на реакции запасания резервных питательных веществ;
• · для координации анаболических и катаболических путей. АТФ и АДФ - аллостерические эффекторы, действующие как антагонисты;
• · для координации параллельно протекающих и взаимосвязанных метаболических путей (например, синтез пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, используемых для синтеза нуклеиновых кислот). Таким образом, конечные продукты одного метаболического пути могут быть аллостерическими эффекторами другого метаболического пути.

Аллостерические эффекторы. Эффектор, вызывающий снижение (ингибирование) активности фермента, называют отрицательным эффектором, или ингибитором. Эффектор, вызывающий повышение (активацию) активности ферментов, называют положительным эффектором, или активатором.

Аллостерическими эффекторами часто служат различные метаболиты. Конечные продукты метаболического пути - часто ингибиторы аллостерических ферментов, а исходные вещества - активаторы. Это так называемая гетеротропная регуляция. Такой вид аллостерической регуляции очень распространён в биологических системах.

Более редкий случай аллостерической регуляции, когда сам субстрат может выступать в качестве положительного эффектора. Такая регуляция называется гомотропной (эффектор и субстрат - одно и то же вещество). Эти ферменты имеют несколько центров связывания для субстрата, которые могут выполнять двойную функцию: каталитическую и регуляторную. Аллостерические ферменты такого типа используются в ситуации, когда субстрат накапливается в избытке и должен быстро преобразоваться в продукт.

Выявить ферменты с аллостерической регуляцией можно, изучая кинетику этих ферментов.

Особенности строения и функционирования аллостерических ферментов:

обычно это олигомерные белки, состоящие из нескольких протомеров или имеющие доменное строение;

они имеют аллостерический центр, пространственно удалённый от каталитического активного центра;

эффекторы присоединяются к ферменту нековалентно в аллостерических (регуляторных) центрах;

аллостерические центры, так же, как и каталитические, могут проявлять различную специфичность по отношению к лигандам: она может быть абсолютной и групповой. Некоторые ферменты имеют несколько аллостерических центров, одни из которых специфичны к активаторам, другие - к ингибиторам.

протомер, на котором находится аллостерический центр, - регуляторный протомер, в отличие от каталитического протомера, содержащего активный центр, в котором проходит химическая реакция;

аллостерические ферменты обладают свойством кооперативности: взаимодействие аллостерического эффектора с аллостерическим центром вызывает последовательное кооперативное изменение конформации всех субъединиц, приводящее к изменению конформации активного центра и изменению сродства фермента к субстрату, что снижает или увеличивает каталитическую активность фермента;

регуляция аллостерических ферментов обратима: отсоединение эффектора от регуляторной субъединицы восстанавливает исходную каталитическую активность фермента;

аллостерические ферменты катализируют ключевые реакции данного метаболического пути.

Рисунок 3. Схема, поясняющая работу аллостерического фермента. А - действие отрицательного эффектора (ингибитора); Б - действие положительного эффектора (активатора).

Локализация аллостерических ферментов в метаболическом пути.

Скорость метаболических процессов зависит от концентрации веществ, использующихся и образующихся в данной цепи реакций. Такая регуляция представляется логичной, так как при накоплении конечного продукта он (конечный продукт) может действовать как аллостерический ингибитор фермента, катализирующего чаще всего начальный этап данного метаболического пути:

Фермент, катализирующий превращение субстрата А в продукт В, имеет аллостерический центр для отрицательного эффектора, которым служит конечный продукт метаболического пути F. Если концентрация F увеличивается (т.е. вещество F синтезируется быстрее, чем расходуется), ингибируется активность одного из начальных ферментов. Такую регуляцию называют отрицательной обратной связью, или ретроингибированием. Отрицательная обратная связь - часто встречающийся механизм регуляции метаболизма в клетке.

В центральных метаболических путях исходные вещества могут быть активаторами ключевых ферментов метаболического пути. Как правило, при этом аллостерической активации подвергаются ферменты, катализирующие ключевые реакции заключительных этапов метаболического пути:

В качестве примера можно рассмотреть принципы регуляции гликолиза - специфического (начального) пути распада глюкозы (рис. 4). Один из конечных продуктов распада глюкозы - молекула АТФ. При избытке в клетке АТФ происходит ретроингибирование аллостерических ферментов фосфофруктокиназы и пируваткиназы. При образовании большого количества фруктозо-1,6-бисфосфата наблюдают аллостерическую активацию фермента пируваткиназы.

Рисунок 4. Схема положительной и отрицательной регуляции катаболизма глюкозы.

Молекула АТФ участвует в ретроингибировании аллостерических ферментов фосфофруктокиназы и пируваткиназы. Фруктозе-1,6-бисфосфат - активатор метаболического пути распада глюкозы. Плюсами отмечена активация, минусами - ингибирование ферментов.

Благодаря такой регуляции осуществляется слаженность протекания метаболического пути распада глюкозы.

Московская медицинская академия имени И.М. Сеченова

Кафедра общей химии

Реферативная работа №1

Студентки 1 курса 9 группы

Факультета ВСО заочного отделения

Ромашковой Екатерины Дмитриевны

Москва 2010

Механизмы регуляции метаболических процессов

А. Основные механизмы регуляции метаболических процессов

Активность всех путей обмена веществ постоянно регулируется, что обеспечивает соответствие синтеза и деградации метаболитов физиологическим потребностям организма. В этом разделе рассматриваются механизмы такой регуляции. Более детально вопросы регуляции клеточного метаболизма представлены на.Поток метаболитов в обмене веществ определяется прежде всего активностью ферментов .Для воздействия на тот или иной путь достаточно регулировать активность фермента, катализирующего наиболее медленную стадию. Такие ферменты, называемые ключевыми ферментами , имеются в большинстве метаболических путей. Активность ключевого фермента регулируется на трех независимых уровнях,

Контроль транскрипции. Контроль за биосинтезом фермента (1) осуществляется на генетическом уровне. Прежде всего речь идет о синтезе соответствующей мРНК (mRNA), а также о транскрипции кодирующего фермент гена, т.е. о регуляции транскрипции .В этом процессе принимают участие регуляторные белки (RP) (факторы транскрипции), действие которых направлено непосредственно на ДНК. К тому же в генах имеются специальные регуляторные участки - промоторы - и участки связывания регуляторных белков (регуляторные элементы). На эффективность действия этих белков влияют метаболиты или гормоны. Если этот механизм усиливает синтез фермента, говорят об индукции , если же снижает или подавляет - о репрессии . Процессы индукции и репрессии осуществляются лишь в определенный отрезок времени.

Взаимопревращение. Значительно быстрее, чем контроль транскрипции, действует взаимопревращение ключевых ферментов (2). В этом случае фермент присутствует в клетке в неактивной форме. При метаболической потребности по сигналу извне и при посредничестве вторичного мессенджера активирующий фермент (E 1) переводит ключевой фермент в каталитически активную форму. Если потребность в этом пути обмена веществ отпадает, инактивирующий фермент (E 2) снова переводит ключевой фермент в неактивную форму. Процесс взаимопревращения в большинстве случаев состоит в АТФ-зависимом фосфорилировании ферментных белков протеинкиназой и соответственно дефосфорилировании фосфатазой .В большинстве случаев более активна фосфорилированная форма фермента, однако встречаются также и противоположные случаи.

Модуляция лигандами. Важным параметром, контролирующим протекание метаболического пути, является потребность в первом реагенте (здесь это метаболит А). Доступность метаболита А возрастает с повышением активности метаболического пути (3), в котором образуется А, и падает с повышением активности других путей (4), в которых А расходуется. Доступность А может быть ограничена в связи с его транспортом в другие отделы клетки.

Часто лимитирующим фактором является также доступность кофермента (5). Если кофермент регенерируется по второму независимому пути, этот путь может лимитировать скорость основной реакции. Таким образом, например, гликолиз и цитратный цикл регулируются доступностью НАД + .Так как НАД + регенерируется в дыхательной цепи, последняя регулирует катаболизм глюкозы и жирных кислот.Наконец, активность ключевого фермента может регулироваться лигандом (субстратом, конечным продуктом реакции, коферментом, другим эффектором) как аллостерическим эффектором путем связывания его не в самом активном центре, а в другом месте фермента, и вследствие этого изменением ферментативной активности.Ингибирование ключевого фермента часто вызывается конечными продуктами реакции соответствующей метаболической цепи (ингибирование по типу обратной связи ) или метаболитом, участвующим в другом пути. Стимулировать активацию фермента может также первый реагент реакционной цепи.

Гормональная регуляция метаболизма

Катализируемые ферментами активация и соответственно инактивация ключевых ферментов промежуточного метаболизма называются взаимопревращениями . Такие процессы находятся под разнообразным контролем, и том числе и гормональным. В этом разделе рассмотрены процессы взаимопревращений, осуществляющие регуляцию метаболизма гликогена в печени.

А. Гормональная регуляция расщепления гликогена

Гликоген служит в организме резервом углеводов, из которого в печени и мышцах путем расщепления быстро создается глюкозофосфат.Скорость синтеза гликогена определяется активностью гликоген-синтазы (на схеме внизу справа), в то время как расщепление катализируется гликоген-фосфорилазой (на схеме внизу слева). Оба фермента действуют на поверхности нерастворимых частиц гликогена, где они в зависимости от состояния обмена веществ могут находиться в активной или неактивной форме. При голодании или в стрессовых ситуациях (борьба, бег) возрастает потребность организма в глюкозе. В таких случаях выделяются гормоны адреналин и глюкагон . Они активируют расщепление и ингибируют синтез гликогена. Адреналин действует в мышцах и печени, а глюкагон - только в печени.

Оба гормона связываются с рецепторами на плазматической мембране (1) и активируют при посредничестве G-белков аденилатциклазу (2), которая катализирует синтез 3",5"-цикло-AMФ (цАМФ) из АТФ (АТР). Зеркально противоположным является действие на этот «вторичный мессенджер » фосфодиэстеразы цАМФ (3), гидролизующей цАМФ до АМФ (AMP). В печени диэстераза индуцируется инсулином, который поэтому не препятствует воздействию двух других гормонов (не показано). цАМФ связывается и тем самым активирует протеинкиназу А (4), которая действует по двум направлениям: с одной стороны, с помощью фосфорилирования с участием АТФ в качестве кофермента она переводит в неактивную D-форму гликоген-синтазу и вследствие этого останавливает синтез гликогена (5); с другой, активирует - также путем фосфорилирования - другую протеинкиназу, киназу фосфорилазы (8). Активная киназа фосфорилазы фосфорилирует неактивную b-форму гликоген-фосфорилазы , превращая ее в активную а-форму (7). Это приводит к высвобождению из гликогена глюкозо-1-фосфата (8), который после превращения в глюкозо-6-фосфат с участием фосфоглюкомутазы включается в гликолиз (9). В печени дополнительно образуется свободная глюкоза, которая поступает в кровь (10).

По мере уменьшения уровня цАМФ активируются фосфопротеинфосфатазы (11), которые дефосфорилируют различные фосфопротеины описанного каскада и тем самым останавливают расщепление гликогена и инициируют его синтез. Эти процессы протекают в течение нескольких секунд, так что метаболизм гликогена быстро адаптируется к измененным условиям.

Б. Взаимопревращение гликоген-фосфорилазы

Структурные изменения, которые сопровождают взаимопревращения гликоген-фосфорилазы, были установлены рентгеноструктурным анализом. Фермент представляет собой димер с симметрией второго порядка. Каждая субъединица имеет активный центр, который расположен внутри белка и в b-форме плохо доступен для субстрата. Взаимопревращение начинается с фосфорилирования серинового остатка (Ser-14) вблизи N-конца каждой из субъединиц. С фосфатными группами связываются остатки аргинина соседних субъединиц. Связывание инициирует конформационные перестройки, которые существенно увеличивают сродство фермента к аллостерическому активатору АМФ. Действие АМФ и влияние конформационных изменений на активные центры приводят к возникновению более активной а-формы. После удаления фосфатных остатков фермент самопроизвольно принимает исходную b-конформацию.

Гормональная регуляция метаболизма жирных кислот

метаболизм фермент гормональная регуляция

Адреналин и глюкагон активируют внутриклеточную липазу. Действие этих гормонов опосредовано аденилатциклазным каскадом реакций, начиная с активации аденилатциклазы и заканчивая фосфорилированием липазы, которая при этом переходит в активную форму и расщепляет эфирные связи в ТАГ. Глицерол как растворимое в плазме вещество транспортируется в печень, где используется в реакциях глюконеогенеза. Жирные кислоты транспортируются кровью в виде комплексов с сывороточными альбуминами в разные органы и ткани, где включаются в процесс окисления.

Гормональная регуляция метаболизма белков обеспечивает обеспечивает динамическое равновесие их синтеза и распада.

· Анаболизм белков контролируется гормонами аденогипофиза (соматотропин ), поджелудочной железы (инсулин ), мужских половых желез (адроген ). Усиление анаболической фазы метаболизма белков при избытке этих гормонов выражается в усиленном росте и увеличении массы тела. Недостаток анаболитических гормонов вызывает задержку роста у детей.

· Катаболизм белков регулируется гормонами щитовидной железы (тироксин и трийодтиронон ), коркового (клюкокортикоиды ) и мозгового (адреналин ) вещества надпочечников. Избыток этих гормонов усиливает распад белков в тканях, что сопровождается истощением и отрицательным азотистым балансом. Недостаток гормонов, например, щитовидной железы сопровождается ожирением.